实验13 纸色谱分离氨基酸（Separation of Amino Acidsby Paper Chromatography）
【实验目的】
（1）了解纸色谱的原理和应用；
（2）掌握纸色谱分离氨基酸的操作技术。
【实验原理】
本实验以氨基酸已知样分析氨基酸的混合液组成，由于混合液中各氨基酸极性的不同，经过一定时间的展开，不同氨基酸随着展开剂——正丁醇:乙酸:水（4:1:5）在滤纸上移动的速率不同，从而相互分离。用茚三酮溶液显色后，与氨基酸已知样的Rf相比较，可鉴定氨基酸混合液的成分。
【基本操作预习】
纸色谱（http://202.118.167.67/jpkdata/video/yjhx22/yjhxsy/sepufa-2.htm）
【实验步骤】
（1）配制展开剂 正丁醇:乙酸:水=4:1:5（体积比）按它们用量比例，先将正丁醇与水在分液漏斗中一起振摇10～15min，然后加乙酸再振荡。静置分层，下层弃去，上层作为展开剂，将展开剂倒入色谱缸内盖上盖，放置0.5h，使缸内形成饱和蒸气。
（2）配制显色剂 95份正丁醇及5份（体积比）2mol/L的CH3COOH混合作为溶剂，加入茚三酮配成0.1％的溶液。
（3）点样 取5cm×30cm的滤纸一张，在距离一端2cm处用铅笔轻画一直线，在直线上用铅笔轻轻地画4个“×”号，并注上号码1、2、3、4，在1、2、3点上用毛细管（管口要齐）分别点上甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸已知样，在第四点上，点上混合样，每点一次样品，就用吹风机以温热的风吹干或晾干，每个样品点三次。
（4）显色 喷上前面配制的显色剂到刚好润湿滤纸，用吹风机吹干，并在85～90℃烘干，显出紫红色斑点。
（5）计算各组分的Rf，鉴定混合液的组分。
【思考题】
（1）在滤纸上记录原点位置时，为什么可以用铅笔画线，而不能用钢笔或圆珠笔画线？
（2）点样的斑点为什么要控制一定的大小？
（3）展开时，样点能否在展开剂液面之下，为什么？
（4）单独氨基酸的Rf与其在混合液中该氨基酸的Rf（操作条件相同）是否相同？为什么？
2.8.4 气相色谱
气相色谱法（gas chromatography，GC）是20世纪50年代初发展起来的一种分离和分析新技术，它是以气体为流动相的色谱法。该法具有快速、高效、高灵敏度分离的特点。可用于沸点在500℃以下、热稳定的挥发物质的分离和测定，目前已广泛应用于石油工业、有机合成、生物化学和环境监测等领域中。
2.8.4.1 基本原理
气相色谱的流动相是载气，固定相则有固体与液体之分。固定相是固体的称为气固色谱（gas solid chromatography，GSC），固定相是液体的称为气液色谱（gas liquid chromatography，GLC）。
（1）气固色谱法 气固色谱法在色谱柱中用作固定相的填充剂一般是吸附剂。各种吸附剂的化学组成及其性能列于表2-10中，可以根据分析对象，参照此表的介绍，选择合适的吸附剂。由表2-10中可以看出，前4种吸附剂填充的气固色谱柱主要是用于分析永久性气体及低沸点烃类，而高分子多孔微球（GDX）填充剂则适合分析极性低分子有机化合物。
表2-10 气固色谱常用吸附剂及其性能
气固色谱法分离混合物的原理是根据吸附剂表面对样品各组分的物理吸附能力不同而达到分离目的，属于吸附色谱。进行操作时，以惰性气体或永久性气体（如H2、N2、He、Ar等）作为流动相（或称载气），载气以一定的速率流过色谱柱，将欲分析的气体试样带入色谱柱，由于柱内的吸附剂对气体各组成部分的吸附能力不同，难以被吸附的组分随载气向前移动的速率较快，较易被吸附的组分则移动速率较慢，这样各组分将彼此分离，先后流出色谱柱。
（2）气液色谱法 在气液色谱中，固定相是小颗粒固体（载体）表面吸附高沸点的液体（固定液），利用被分析样品中各组分在固定液中溶解度的差异而将混合物分离，属于分配色谱。
①载体 气液色谱的色谱柱的填充剂是一种多孔性的固体颗粒，它提供惰性表面，用以承担固定液，称为载体。对载体的要求是：表面积较大，孔径分布均匀；化学惰性好，即表面没有吸附性或吸附性能很弱，不与被分离的物质发生化学反应；热稳定性好，有一定的机械强度。载体的品种很多，可以分为硅藻土与非硅藻土两大类型，其性能见表2-11。
表2-11 气液色谱常用载体的分类及性能比较
②固定液 吸附在载体表面上的高沸点液体称为固定液。在气液分配色谱中，载气一旦确定，固定液的选择能否有效分离试样各组分是一个决定因素。通常根据“相似性”的原则选择固定液，即固定液的结构、性质、极性与被分离的组分相似或相近。
分离非极性的烃类化合物时，要用非极性的固定液，如角鳖烷等。此时低沸点组分先流出，高沸点物质后流出；如果混有极性物质且沸点相同，则极性较强者先流出。对于分离中等极性的物质，选用中等极性的固定液，如邻苯二甲酸二壬酯，组分基本按沸点顺序流出，沸点相同、极性较强的后流出。含有强极性基团的组分一般选用极性固定液，如有机皂土-34，极性弱的组分先流出，极性强的组分后流出。分离能形成氢键的组分，选用氢键型固定液，如三乙醇胺，一般是形成氢键能力弱的组分先流出，形成氢键能力强的后流出。
此外固定液还必须具备热稳定性好、蒸气压低、在操作温度下应呈液态等条件。目前固定液的种类很多，常见的固定液见表2-12。
表2-12 常见的固定液
2.8.4.2 气相色谱仪
气相色谱仪示意如图2-43所示，一般由载气系统，分离系统，检测、记录和数据处理系统三部分组成。
图2-43 气相色谱仪示意
1—高压钢瓶；2—减压阀；3—精密调压阀；4—净化干燥；5—压力表；6—热导池；7—进样器；8—色谱柱；9—皂膜流速计；10—测量电桥；11—记录仪
（1）载气系统 载气系统主要是储于钢瓶中的氮气、氢气或氦气，用减压阀控制载气流量，用皂膜流量计测量载气流速，流速一般控制在30～120mL/min。
（2）分离系统 分离系统包括色谱柱、进样器、恒温箱和有关电气控制单元。常用的色谱柱有玻璃管柱、不锈钢管柱等，内径2～6mm，长1～3m，弯成U形或螺旋形；另一种是毛细管柱，内径0.1～0.75mm，长20～200m。色谱柱内填满了吸附剂或涂渍有固定液的载体。
（3）检测、记录和数据处理系统 该系统包括检测器、记录器和积分仪或微处理机等。检测器能够检知和测定试样组成及各组分含量，它将经色谱柱分离后的各组分按其特性及含量转换为相应的电信号。常用的检测器有热导检测器、氢火焰离子化检测器、电子捕获检测器等。检测器应具有敏感、应答快、线性范围宽、通用性和特征性及性能稳定可靠、操作方便等特点。
2.8.4.3 操作步骤
参考仪器说明书将有关部件安装好，检查各系统接头确保不漏气后，即可开始操作。在保持压力的情况下，让载气（氢、氮、氦、氩）通过色谱柱，使载气流速控制在所需要的流速范围。加热色谱柱至所需要的温度，用微量的注射器将样品注入进样室，试样进入后立即气化并被载气带入色谱柱，在柱中样品按照它们的气相和液相之间的分配系数进行分配（气液色谱），已分离的样品组分离开柱子后，依次进入检测器，检测器的作用是将分离的每个组分按其浓度大小定量地转换成电信号，经放大后，被记录仪记录下来。
2.8.4.4 气相色谱分析
（1）定性分析 当每一组分从柱中洗脱后进入检测器，在色谱上就出现一个峰，当空气随试样进去后，因为空气挥发性高，它就和载气一样最先通过色谱柱，故第一个峰为空气峰。从试样被注入到一个信号峰的最大值时经过的时间称为某一组分的保留时间，如图2-44中组分A的保留时间用tr（A）表示，为3.6min，在色谱条件相同的条件下，一个化合物的保留时间是一个特定常数。
图2-44 三组分混合物的气相色谱
通过比较未知物与已知物的保留时间，可以鉴定未知物。若在相同的色谱条件下，未知物和已知物的保留时间不相同，则可认为是不同的化合物；保留时间相同，两者可能是同一物质，也可能不是，因为许多有机化合物在特定的色谱条件下有相同的保留时间。为了准确地进行定性分析，必须至少用两种极性不同的固定液进行分析，如果未知物和已知物在不同的固定液中有相同的保留时间，则说明是同一化合物；如果在此两种固定液情况下都出现一个峰，则通常可以认为该物质是单一的。
（2）定量分析 气相色谱也是定量分析少量挥发性混合物的有效工具。定量进行分析的依据是每个组分的含量（质量或物质的量）与每个组分的峰面积（或峰高）成正比：
mi=Aifi
式中，mi为组分的含量；Ai为峰面积；fi为绝对校正因子。所以利用气相色谱作定量分析时，首先要准确地求出峰面积或峰高，其次求出校正因子。市售较先进的气相色谱仪常配有积分仪，都能将色谱图上的某组分的峰面积和保留时间记录下来。
峰面积的测定方法有几种，其中最简便的是峰高乘以半高宽：
A=hW1/2
式中，W1/2为h/2处的宽度。这样测定的峰面积为实际峰面积的0.94，但在做相对计算时不影响定量结果。
由于绝对校正因子不易测定，实际工作中多采用相对校正因子
：
只要知道待测物质与标准物质的浓度，再分别测定相应的峰面积，即可求出相对校正因子。
气相色谱法中各组分的含量常用三种方法求出：外标法（与外标样比较）、归一化法（混合物的总峰面积为100％）、内标法（将一定浓度的标液加到样品中）。通常用归一化法计算含量。
归一化法是先测样品各组分的峰面积和相对校正因子，然后计算各组分的质量分数：
式中，A1、A2、A3为样品各组分的峰面积；
为各组分的相对校正因子。此法要求样品组分全部流出色谱柱，并有相应的色谱峰。
2.8.5 高效液相色谱
高效液相色谱也称高压液相色谱（high performance/pressure liquid chromatography，HPLC），它是以经典的液相色谱为基础，以高压下的液体为流动相的色谱过程。高效液相色谱是20世纪60年代后期发展起来的一种分析方法，目前已成为现代分析化学中最重要的分离方法之一。
与气相色谱法相比，高效液相色谱对样品的适用性更广。对于气相色谱无法分析的高沸点化合物、离子型化合物、热不稳定物质等都可用高效液相色谱分析，弥补了气相色谱的不足。
2.8.5.1 基本原理
（1）高效液相色谱的分类 在高效液相色谱中，按固定相和流动相相对极性的不同分为正相和反相两种系统。凡是固定相极性强于流动相的称正相色谱系统；固定相极性弱于流动相的则称反相色谱系统。另外，根据分离过程的机理，在高效液相色谱中又有以下分类。
①液固吸附色谱 组分按其在两相吸附作用的强弱进行分离，被固定相吸附较弱的先从色谱柱流出。
②液液分配色谱 此时作为流动相和固定相的液液两相是不互溶的，作为固定相的液相承载在载体下，通常还用一个预饱和柱借流动相的流动不断把固定液带入色谱柱以保持它的分离过程中的浓度不变。组分的液体分配色谱按其在两相的分配比不同进行分离。
③离子交换色谱 离子交换色谱用离子交换剂作固定相，是分离离子型化合物较好的方法，不同组分按其离子交换能力的不同进行分离。
④凝胶渗透色谱（又称排阻色谱） 按分子大小不同进行分离是凝胶渗透色谱的特点，它在分离分析中起着十分重要的作用。
⑤亲和力色谱 亲和力色谱又称生物亲和力色谱，是利用不同组分对固定相亲和力的差别进行分离的操作，这是分离、提纯蛋白质、酶等的有效方法。
（2）高效液相色谱的流动相 液相色谱的流动相在分离过程中有较重要的作用，在选择液相色谱的流动相时不仅要考虑到检测器的需要，同时也要注意到它在分离过程中所起的作用。常用的流动相正相有正己烷、异辛烷、二氯甲烷等，反相有水、乙腈、甲醇等，另外还有多种缓冲溶液。液相色谱的流动相在使用前一般都要过滤、脱气，必要时需进一步纯化。
凡是在整个过程中流动相的浓度不随时间而变的称为等度冲洗；若过程中流动相的浓度随时间而变则称为梯度冲洗或梯度洗脱。
（3）固定相 常用的液相色谱固定相有全多孔型、薄壳型（又称多孔层微珠）和化学改性型等。在液液分配色谱中，反相色谱最常用的固定相是十八烷基键合相，即把十八烷基键合到硅胶表面。正相色谱常用的是氨基、氰基键合固定相。
2.8.5.2 高效液相色谱仪
高效液相色谱仪主要由储液罐、高压泵、进样器、色谱柱和检测器等构成，简单流程示意见图2-45。
图2-45 高效液相色谱流程示意
1—储液罐；2—过滤器；3—高压泵；4—压力表；5—进样器；6—色谱柱；7—检测器；8—样品收集；9—记录仪
经脱气的流动相从储液罐通过过滤器，用高压泵连续地按一定流量将流动相送入色谱柱中。然后，用进样器将样品注入色谱柱的顶端，再用流动相连续地冲洗色谱柱，样品各组分会逐渐被分离开，并按照一定顺序从柱后流出，进入检测器，并将检测信号送入记录仪，绘出各组分的色谱峰。
（1）高压泵 高质量的高效液相色谱仪必须有一台好的高压泵（压力范围40～4500N/cm2）。理想的泵应该具有脉动小或无脉动、储液量大、流量及压力稳定、调节方便（一般要求流量调节范围为0.5～6.0mL/s）、清洗方便、可做成梯度、耐腐蚀、长寿命等特点。往复泵的出现，较大程度地满足了高效液相色谱对高压泵的性能要求。
（2）检测器 常用液相色谱检测器有紫外检测器、示差折光检测器、荧光检测器、电导检测器等。其中紫外检测器是一种选择性浓度检测器，对在检测波长下有吸收的物质能检测，无吸收的物质不能检测。紫外检测具有灵敏度高、噪声低等优点，广泛应用于高效液相色谱。
2.8.5.3 高效液相色谱的定性和定量方法
定性和定量方法与气相色谱法基本相同。
（1）定性方法 主要有色谱法、化学鉴定法以及两谱两用技术鉴定。
色谱法是利用纯物质和样品的保留时间对照，进行鉴定；化学鉴定法是对收集的组分进行化学定性；两谱联用是使用HPLC-MS（高效液相色谱-质谱）、HPLC-NMR（高效液相色谱-核磁）、HPLC-FTIR联用仪（高效液相色谱-傅里叶红外光谱），进行色谱峰的鉴定。
（2）定量方法 利用峰高或峰面积进行定量，常用的方法有归一化法、外标法及内标法等。现在高效液相色谱仪自带数字积分仪系统，自动测量、记录和储存色谱峰高、峰面积、保留时间等大量数据，并能进行定量运算，给出定量结果。